Недавно произошла вторая атака на ПЦР-диагностику COVID-19. Есть несколько упрямых мифов или, скорее, твердынь, которые некритически повторяются. Их довольно легко опровергнуть, для человека, который работает с ПЦР, интерпретирует данные ПЦР и вообще вся технология ПЦР является частью его повседневной жизни, - объясняет доктор Иван Димов.
Он объясняет некоторые из наиболее распространенных заблуждений относительно тестов ПЦР, а также того, что представляет собой этот диагноз, ставший популярным во время пандемии COVID-19.
1. Разве FDA не отказало в проведении ПЦР-тестов?
Нет, вообще говоря, CDC просто перестают поддерживать свои домашние ПЦР-тесты. Другие продолжают использоваться и разрешаться. На сайте FDA вы можете найти список одобренных тестов на COVID-19, среди которых есть десятки тестов ПЦР. Вы можете проверить сами из первоисточника .
2. Первооткрыватель ПЦР Кэрри Маллис сказала, что ее не следует использовать для диагностики!
Любимое клише. Если кто-нибудь придумает этот гамбит, спросите, в чем именно возражала Кэрри Маллис против тестов ПЦР - пока я только поднимаю шум и напыщенно игнорирую этот вопрос.
В остальном Керри Маллис, скончавшийся летом 2019 года, является хорошо известным случаем Нобелевской болезни - есть ряд неизмеримых заявлений, вопреки экспертному консенсусу, по темам, в которых он не является экспертом (глобальное потепление, ВИЧ). Я проигнорирую это и буду комментировать, не ссылаясь на его репутацию в качестве аргумента. Однако это верно в обоих направлениях - первооткрыватель реакции, процесса и технологии не учитель Фома Аквинский и не последний авторитет в этом вопросе на протяжении веков. Его утверждения, как и любой другой ученый, подлежат обзору и критике.
Его возражения направлены не столько против ПЦР, сколько против его необоснованного отрицания связи между вирусом ВИЧ и СПИДом. Кроме того, действительно есть более конкретные возражения против тестов ПЦР - что тест, по его мнению, является качественным, а не количественным, т.е. мы можем сказать, есть ли вирус или нет, но мы не можем точно сказать, сколько вирусов было в образце (т.е. расчеты вирусной нагрузки на основе положительного цикла неточны, согласно Кэрри Маллис, а не общее использование ПЦР для диагноз - сам консультировал по вопросам разработки ПЦР-тестов на ВИЧ, несмотря на свои возражения).
3. Тест обнаруживает другие тривиальные вирусы (есть ложные срабатывания), чтобы нас выключить!
Тесты ПЦР имеют относительно более высокую чувствительность и специфичность по сравнению с другими категориями тестов. Эта относительно высокая точность обусловлена ??взаимодействием короткого праймера с длинной цепью ДНК - это почти как ключ и замок - небольших различий между ними достаточно, чтобы предотвратить их соединение и, следовательно, первый этап реакции (см. вопрос 4 для описания). На практике ложноположительный тест может иметь место только в случае лабораторной ошибки или загрязнения. Ложноотрицательный результат теста может быть по разным причинам - отбор образцов является непростой задачей, хранение и обработка образцов может быть несовершенной, вирус может покинуть носоглотку и оказаться в нижних дыхательных путях и т. Д.
В этом случае тесты РНК на COVID-19 ищут несколько сегментов вирусного генома, кодирующих разные белки. Эти сегменты специфичны для COVID-19. Их нет в геноме вирусов гриппа. Если кто-то говорит, что тест ПЦР путает треску с гриппом, попросите его сказать вам, какой именно сегмент генома вызывает перекрытие. В Интернете можно найти геномы вирусов гриппа и covid (которые очень разные), так что это утверждение легко проверить. Пока что на этот вопрос больше не ответили, так как я спрашивал людей, которые утверждают, что ковид обнаруживает грипп. То же самое и с другими банальными инфекциями - риновирусами, аденовирусами и т. Д. - у них нет генетического сходства с covid для положительного результата теста.
Но, допустим, он лжет о банальных коронавирусах, вызывающих простуду. Это включает роль последовательности. Некоторые из всех положительных образцов секвенируются - считывается весь их геном (это отдельный пост, для этого есть ряд методов - секвенирование по Сэнгеру, секвенирование Illumina, секвенирование нанопор). Оттуда поступают данные о различных вариантах и ??их распределении. Другими словами, если бы было какое-либо значительное количество ложноположительных тестов, вызванных тривиальными коронавирусами, это было бы очевидно в данных последовательности.
Картина немного отличается в серологических тестах (основанных на взаимодействиях антиген / антитело). Они полагаются на взаимодействие между белками, а не нуклеиновыми кислотами. Этот тип взаимодействия гораздо более неспецифичен (как между рукой и перчаткой, чем между ключом и замком), поэтому существует теоретическая вероятность того, что тривиальный коронавирус не пройдет такой тест. Однако он относительно невелик, так как тривиальные коронавирусы вызывают около 20% простудных заболеваний, большинство из них так называемые. риновирусы.
4. Что такое ПЦР?
Я дам максимально краткое объяснение, которое в то же время не скупится на важные детали.
ПЦР или полимеразная цепная реакция - это химическая реакция, катализируемая ферментом ДНК-полимеразой. В этой реакции берется денатурированная молекула ДНК (т.е. подвергается термообработке так, чтобы двойная спираль распадалась), короткий сегмент ДНК, называемый праймером, который соответствует (или на жаргоне «комплементарен») короткому сегменту длинная денатурированная молекула, смесь нуклеотидов (ДНК-подобные строительные блоки бусинки) и ферментная ДНК-полимераза. В присутствии этих четырех компонентов и соответствующих условиях (pH, температура, концентрации) реакция может продолжаться. На первом этапе короткий сегмент ДНК связывается с длинной молекулой, образуя комплекс, который имеет небольшую цепь двухцепочечной ДНК и длинный хвост одноцепочечной ДНК.
ДНК-полимераза цепляется за то место, где начинается этот «хвост». Оттуда, как конвейер, он начинает выравнивать более короткий сегмент, присоединяя нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам в единственной цепи (т. Е. Используя хвост в качестве шаблона). Таким образом, исходная молекула ДНК, состоящая из двойных и одинарных сегментов, становится двойной спиралью по всей своей длине. После последующей термообработки эту вновь полученную двойную спираль можно денатурировать, и процесс можно циклически повторять. С завершением каждого цикла количество длинной ДНК геометрически увеличивается - как своего рода молекулярный копировальный аппарат.
Есть очень мало других химических реакций, которые имеют такое промышленное и академическое значение, степень оптимизации, применимость и исследования, как ПЦР. Открытие можно сравнить с открытием кремниевых транзисторов. Последние почти 40 лет биотехнологического прогресса были бы невозможны без ПЦР.
5. Но как проводится такая проверка?
Если мы используем известный праймер (короткий сегмент), мы можем определить его присутствие или отсутствие в образце с неизвестной ДНК. Этот короткий сегмент, например, может быть частью генома интересующего нас вируса или бактерии.
Измеряя концентрацию побочных продуктов реакции ПЦР, которые служат индикатором ее протекания. Т.е. если мы знаем, что произошла реакция ПЦР, то этот сегмент присутствует в образце.
6. Однако коронавирус - это РНК-вирус, какое нам дело до образца ДНК?
В образцах РНК так называемые ОТ-ПЦР или ПЦР с обратной транскриптазой. Он включает обработку образца РНК ферментом, называемым обратной транскриптазой, который делает сегмент ДНК соответствующим РНК в образце.
7. Что означает порог цикла?
Как я уже упоминал, реакцию можно проводить циклически, удваивая количество длинной ДНК и измеряемых побочных продуктов. Когда эти продукты проходят определенное значение, тест считается положительным. Однако, если мы позволим повторять тест на неопределенное время, он будет положительным из-за наличия других побочных эффектов. Для этого существует предел повторений, прежде чем он будет объявлен отрицательным - обычно около 30-40, что зависит от производителя конкретного теста, лаборатории, относительного риска между ложноположительным и ложноотрицательным и т. Д. Положительные тесты обычно появляются примерно после 20 циклов.